Produktuak
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR detektatzeko kit 2019-nCoV-rako
Espero den erabilera
Kit hau koronavirus berriaren (2019-nCoV) detektatzeko kualitatiboki erabiltzen da, eztarriko zintzoiak, nasofaringeak, bronkoalbeolarraren garbiketa-likidoa, esputoa erabiliz. Produktu honen detekzio-emaitza erreferentzia klinikorako baino ez da erabili behar Diagnostiko eta tratamendu klinikorako frogak. Gaixoaren agerpen klinikoekin eta laborategiko beste proba batzuekin batera, egoeraren azterketa integrala gomendatzen da.
Ikuskapen-printzipioa
Kita urrats bakarreko RT-PCR teknologian oinarritzen da.Izan ere, 2019ko koronavirus berria (2019-nCoV) ORF1ab eta N geneak hautatu ziren anplifikazio-helburuko eskualde gisa.Abiarazle espezifikoak eta zunda fluoreszenteak (N gene-zundak FAMrekin etiketatzen dira eta ORF1ab zundak HEXarekin etiketatzen dira) laginetan 2019 mota berriko koronavirusaren RNA detektatzeko diseinatuta daude.Kitak barne-kontroleko detekzio-sistema endogeno bat ere barne hartzen du (CY5-rekin etiketatutako barne-kontroleko gene zunda) laginak biltzeko prozesua, RNA eta PCR anplifikazioa kontrolatzeko, emaitza negatibo faltsuak murrizteko.
Osagai nagusiak
| Osagaiak | Bolumena（48T/Kit） |
| RT-PCR erreakzio-soluzioa | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864 µl |
| Kontrol negatiboa | 1500µl |
| nCOV kontrol positiboa (l ORF1ab N genea) | 1500µl |
Erreaktibo propioak: RNA erauzteko edo arazteko erreaktiboak.Kontrol negatiboa/positiboa: kontrol positiboa xede-zatiak dituen RNA da, eta kontrol negatiboa azido nukleikorik gabeko ura da.Erabilera bitartean, erauzketan parte hartu behar dute eta infekziosotzat hartu behar dira.Dagokion araudiaren arabera maneiatu eta bota behar dira.
Barne erreferentziako genea giza RnaseP genea da.
Biltegiratzeko baldintzak eta iraungitze data
-20 ± 5 ℃, saihestu 5 aldiz baino gehiago izoztea eta desizoztea, 6 hilabeterako balio duena.
Aplikatzeko tresna
FAM / HEX / CY5 eta beste kanal anitzeko PCR fluoreszente tresnarekin.
Aleen eskakizunak
1.Aplikatu daitezkeen ale motak: eztarriko zintzoiak, nasofaringeak, garbiketa bronkoalbeolarraren likidoa, esputoa.
2. Aleen bilketa (teknika aseptikoa)
Faringea: garbitu amigdalak eta atzeko faringearen horma bi laginekin aldi berean, eta murgildu lagin-burua laginketa-soluzioa duen saiakuntza-hodi batean.
Esputoa: pazienteak eztul sakona izan ondoren, bildu eztul egindako esputoa laginketa-soluzioa duen torloju-tapako probeta batean;bronkoalbeolarraren garbiketa-likidoa: mediku profesionalek laginak hartzea.3.Laginak biltegiratzea eta garraiatzea
Birusak isolatzeko eta RNA probak egiteko aleak ahalik eta azkarren probatu behar dira.24 ordutan detekta daitezkeen aleak 4 ℃-tan gorde daitezke;24an detektatu ezin direnak
orduak -70 ℃ edo beherago gorde behar dira (-70 ℃ biltegiratzeko baldintzarik ez badago,
aldi baterako -20 ℃ hozkailuan gordeta).Aleek garraiatzeko garaian behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihestu behar dute.Laginak laborategira bidali behar dira ahalik eta azkarren bildu ondoren.Laginak distantzia luzeetan garraiatu behar badira, izotz lehorra biltegiratzea gomendatzen da.
Proba metodoak
1 Laginak prozesatzea eta RNA erauztea (laginak prozesatzeko eremua)
RNA erauzteko 200μl lagin likido hartzea gomendatzen da.Erlazionatutako erauzketa-urratsetarako, ikusi RNA erauzteko kit komertzialen argibideak.Bai negatiboa eta bai negatiboa
kit honetako kontrolak erauzketan parte hartu zuten.
2 PCR erreaktiboen prestaketa (erreaktiboak prestatzeko gunea)
2.1 Kendu osagai guztiak kittik eta desizoztu eta nahastu giro-tenperaturan.Zentrifugatu 8.000 bira/mintan segundo batzuetan erabili aurretik;kalkulatu behar den erreaktibo kopurua, eta erreakzio-sistema ondoko taulan agertzen den moduan prestatzen da:
| Osagaiak | N zerbitzatu (25µl sistema) |
| nCOV primer TaqMan probenahasketa | 18 µl × N |
| RT-PCR erreakzio-soluzioa | 2 µl × N |
| *N = probatutako lagin kopurua + 1 (kontrol negatiboa) + 1 (nCOVkontrol positiboa) | |
2.2 Osagaiak ondo nahastu ondoren, zentrifugatu denbora laburrean hodiaren hormako likido guztia hodiaren behealdera eror dadin, eta, ondoren, 20 µl-ko anplifikazio-sistema PCR hodian.
3 Laginketa (aleak prestatzeko gunea)
Gehitu kontrol negatibo eta positiboetatik 5μl erauzketa ondoren.Aztertu beharreko laginaren RNA PCR erreakzio-hodian gehitzen da.
Estali ondo hodia eta zentrifugatu 8.000 rpm-an segundo batzuetan anplifikazioa detektatzeko gunera eraman aurretik.
4 PCR anplifikazioa (anplifikatutako detekzio eremua)
4.1 Jarri erreakzio-hodia tresnaren lagin-gelaxkan, eta ezarri parametroak honela:
| etapa | Zikloa zenbakia | Tenperatura(°C) | Denbora | bildumagunea |
| Alderantziztranskripzioa | 1 | 42 | 10min | - |
| Desnaturalizazio aurrekoan | 1 | 95 | 1min | - |
| Zikloa | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30eko hamarkada | datu bilketa |
Tresna detektatzeko kanala hautatzea: hautatu FAM, HEX, CY5 kanala fluoreszentzia seinalerako.Erreferentzia fluoreszentea EZER, mesedez, ez aukeratu ROX.
5 Emaitzen azterketa (mesedez, ikusi tresna bakoitzaren argibide esperimentalak ezarpenerako)
Erreakzioaren ondoren, gorde emaitzak.Aztertu ondoren, egokitu hasierako balioa, amaierako balioa eta atalasearen balioa irudiaren arabera (erabiltzaileak benetako egoeraren arabera egokitu dezake, hasierako balioa 3 ~ 15ean ezarri daiteke, amaierako balioa ezar daiteke. 5~20, doikuntza) grafiko logaritmikoan Leihoaren atarian, atalase-lerroa fase logaritmikoan dago, eta kontrol negatiboaren anplifikazio-kurba lerro zuzena edo atalase-lerroaren azpian dago).
6 Quauty kontrola (Prozedura-kontrol bat sartzen da proban) Kontrol negatiboa: FAM, HEX, CY5 detektatzeko kanaletarako anplifikazio-kurba nabaririk ez
COV kontrol positiboa: FAM eta HEX detektatzeko kanalen anplifikazio kurba nabaria, Ct balioa≤32, baina CY5 kanalaren anplifikazio kurbarik ez;
Aurreko baldintzak aldi berean bete behar dira esperimentu berean;bestela, esperimentua baliogabea da eta errepikatu egin behar da.
7 Emaitzen zehaztapena.
7.1 Test laginaren FAM eta HEX kanaletan anplifikazio-kurba edo Ct balio> 40 ez badago eta CY5 kanalean anplifikazio-kurba bat badago, 2019ko koronavirus berririk (2019-nCoV) ez dagoela iritzi daiteke. RNA laginean;
.2 Proba-laginak FAM eta HEX kanaletan anplifikazio-kurba nabariak baditu, eta Ct balioa ≤40 bada, lagina 2019ko koronavirus berriarentzat (2019-nCoV) positiboa dela iritzi daiteke.
7.3 Proba-laginak anplifikazio-kurba argia badu FAM edo HEX kanal batean bakarrik, eta Ct balioa ≤40 bada, eta beste kanalean anplifikazio-kurbarik ez badago, emaitzak berriro probatu behar dira.Berriro probaren emaitzak koherenteak badira, lagina berriarentzat positiboa dela iritzi daiteke
koronavirusak 2019 (2019-nCoV).Berriro probaren emaitza negatiboa bada, 2019ko koronavirus berrirako (2019-nCoV) lagina negatiboa dela iritzi daiteke.
Judizio positiboaren balioa
ROC kurbaren metodoa kitaren erreferentzia CT balioa zehazteko erabiltzen da eta barne-kontroleko erreferentzia-balioa 40 dira.
Proben emaitzen interpretazioa
1.Esperimentu bakoitza kontrol negatibo eta positiboak probatu behar dira.Proben emaitzak kontrolak kalitate-kontroleko baldintzak betetzen dituztenean soilik zehaztu daitezke
2.FAM eta HEX detektatzeko kanalak positiboak direnean, CY5 kanalaren emaitza (barneko kontrol kanala) negatiboa izan daiteke sistemaren lehiaren ondorioz.
3.Barne-kontrolaren emaitza negatiboa denean, saio-hodiaren FAM eta HEX detektatzeko kanalak ere negatiboak badira, sistema desgaituta dagoela edo funtzionamendua gaizki dagoela esan nahi du, proba baliogabea dela.Horregatik, laginak berriro probatu behar dira.
