Produktuak
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR detekzio-kita 2019-nCoV-rako
Espero den erabilera
Kit hau koronabirus berria (2019-nCoV) kualitatiboa detektatzeko erabiltzen da, eztarriko frotisak, nasofaringeko frotisak, bronkoalbeoloen garbiketa-likidoa eta karkaxa erabiliz. Produktu honen detekzio-emaitza erreferentzia klinikorako baino ez da, eta ez da erabili behar diagnostiko eta tratamendu klinikorako ebidentzia bakar gisa. Egoeraren analisi osoa egitea gomendatzen da, pazientearen adierazpen klinikoekin eta beste laborategiko probekin batera.
Ikuskapen printzipioa
Kitak urrats bakarreko RT-PCR teknologian oinarritzen da. Izan ere, 2019ko koronabirus berriaren (2019-nCoV) ORF1ab eta N geneak hautatu ziren anplifikazio-eskualde helburu gisa. Primer eta zunda fluoreszente espezifikoak (N gene-zundak FAM-ekin etiketatuta daude eta ORF1ab zundak HEX-ekin etiketatuta daude) diseinatuta daude 2019ko koronabirus mota berriaren RNA laginetan detektatzeko. Kitak barne-kontrol detekzio sistema endogeno bat ere badu (CY5-ekin etiketatutako barne-kontrol gene-zunda) laginak biltzeko, RNA eta PCR anplifikazio prozesua kontrolatzeko, horrela emaitza faltsu negatiboak murriztuz.
Osagai nagusiak
| Osagaiak | Bolumena(48T/Kita) |
| RT-PCR erreakzio-soluzioa | 96 µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Kontrol negatiboa | 1500µl |
| nCOV kontrol positiboa (l ORF1ab N genea) | 1500µl |
Erreaktiboak: RNA erauzteko edo arazteko erreaktiboak. Kontrol negatiboa/positiboa: Kontrol positiboa zatiki helburua duen RNA da, eta kontrol negatiboa, berriz, azido nukleikorik gabeko ura. Erabileran zehar, erauzketan parte hartu behar dute eta infekziosotzat hartu behar dira. Dagokion araudiaren arabera manipulatu eta bota behar dira.
Barne erreferentziako genea gizakiaren RnaseP genea da.
Biltegiratze baldintzak eta iraungitze data
-20 ± 5 ℃, saihestu 5 aldiz baino gehiagotan izoztea eta desizoztea, 6 hilabetez baliozkoa.
Aplikagarria den tresna
FAM / HEX / CY5 eta beste kanal anitzeko PCR fluoreszente tresna batzuekin.
Laginaren eskakizunak
1. Aplika daitezkeen lagin motak: eztarriko hisopoak, sudur-faringeko hisopoak, bronkoalbeoloen garbiketa-likidoa, karkaxa.
2. Laginaren bilketa (teknika aseptikoa)
Faringeko hisopoa: Garbitu amigdalak eta faringearen atzeko horma bi hisoporekin aldi berean, eta ondoren sartu hisopoaren burua lagin-soluzioa duen probeta-hodi batean.
Karraska: Pazienteak eztul sakon bat egin ondoren, bildu eztul egindako karraska laginketa-soluzioa duen tapoi torlojudun probeta batean; bronkoalbeoloen garbiketa-likidoa: laginketa mediku profesionalek egingo dute. 3. Laginen biltegiratzea eta garraioa
Birusa isolatzeko eta RNA probatzeko laginak ahalik eta azkarren aztertu behar dira. 24 orduko epean detektatu daitezkeen laginak 4 ℃-tan gorde daitezke; 24 orduko epean detektatu ezin direnak...
ordu -70 ℃-tan edo azpitik gorde behar dira (-70 ℃-ko biltegiratze baldintzarik ez badago, gorde egin behar dira
(aldi baterako -20 ℃-tan hozkailuan gorde). Laginak behin eta berriz izoztea eta desizoztea saihestu behar da garraioan zehar. Laginak bildu ondoren ahalik eta azkarren bidali behar dira laborategira. Laginak distantzia luzeetan garraiatu behar badira, izotz lehorrean gordetzea gomendatzen da.
Proba metodoak
1 Laginaren prozesamendua eta RNA erauzketa (laginaren prozesamendu eremua)
RNA erauzteko 200 μl lagin likido hartzea gomendatzen da. Erauzketa-urrats erlazionatuei buruzko informazioa lortzeko, kontsultatu RNA erauzteko kit komertzialen argibideak. Bai negatiboak bai negatiboak
Kit honetako kontrolak erauzketan parte hartu zuten.
2 PCR erreaktiboen prestaketa (erreaktiboen prestaketa gunea)
2.1 Kendu osagai guztiak kitetik eta desizoztu eta nahastu giro-tenperaturan. Zentrifugatu 8.000 bira/min-tan segundo batzuetan erabili aurretik; kalkulatu behar diren erreaktibo kopurua, eta erreakzio-sistema prestatu taula honetan agertzen den bezala:
| Osagaiak | N anoa (25µl sistema) |
| nCOV primer TaqMan probenahasketa | 18 µl × N |
| RT-PCR erreakzio-soluzioa | 2 µl × N |
| *N = aztertutako laginen kopurua + 1 (kontrol negatiboa) + 1 (nCOV)kontrol positiboa) | |
2.2 Osagaiak ondo nahastu ondoren, zentrifugatu denbora labur batez hodiaren horman dagoen likido guztia hodiaren hondora eror dadin, eta ondoren, 20 µl-ko anplifikazio-sistemaren zati bat sartu PCR hodian.
3 Laginketa (laginak prestatzeko gunea)
Gehitu 5 μl kontrol negatibo eta positibo erauzketaren ondoren. Aztertu beharreko laginaren RNA PCR erreakzio-hodira gehitzen da.
Itxi hodia ondo eta zentrifugatu 8.000 bira/min-tan segundo batzuetan anplifikazio detekzio eremura eraman aurretik.
4 PCR anplifikazioa (detekzio-eremu anplifikatua)
4.1 Jarri erreakzio-hodia tresnaren lagin-zelulan, eta ezarri parametroak honela:
| eszenatoki | Zikloa zenbaki | Tenperatura(°C) | Denbora | bildumagune |
| Alderantzizkoatranskripzio | 1 | 42 | 10 minutu | - |
| Aurre-desnaturalizazioan | 1 | 95 | 1 minutu | - |
| Zikloa | 45 | 95 | 15 segundo | - |
| 60 | 30eko hamarkada | datuen bilketa |
Tresnaren detekzio-kanalaren hautaketa: Hautatu FAM, HEX, CY5 kanala fluoreszentzia-seinalerako. Erreferentziazko fluoreszentziarako NONE, mesedez ez aukeratu ROX.
5 Emaitzen analisia (Mesedez, kontsultatu tresna bakoitzaren argibide esperimentalak ezarpenetarako)
Erreakzioaren ondoren, gorde emaitzak. Analisiaren ondoren, doitu oinarrizko balioa, amaierako balioa eta atalase-balioa irudiaren arabera (erabiltzaileak egoera errealaren arabera doitu dezake, hasierako balioa 3~15era ezar daiteke, amaierako balioa 5~20ra ezar daiteke, doikuntza) grafiko logaritmikoan. Leihoaren atalasean, atalase-lerroa fase logaritmikoan dago, eta kontrol negatiboaren anplifikazio-kurba lerro zuzena edo atalase-lerroaren azpitik dago).
6 Kalitate-kontrola (Proban kontrol prozedurala sartzen da) Kontrol negatiboa: Ez dago anplifikazio-kurba agerikorik FAM, HEX, CY5 detekzio-kanaletarako
COV kontrol positiboa: FAM eta HEX detekzio-kanalen anplifikazio-kurba nabaria, Ct balioa ≤32, baina CY5 kanalaren anplifikazio-kurbarik ez;
Goiko baldintzak aldi berean bete behar dira esperimentu berean; bestela, esperimentua baliogabea izango da eta errepikatu beharko da.
7 Emaitzen zehaztapena.
7.1 Proba-laginaren FAM eta HEX kanaletan anplifikazio-kurbarik edo Ct balioa > 40 badago, eta CY5 kanalean anplifikazio-kurba badago, laginak ez duela 2019ko koronabirus berriaren (2019-nCoV) RNArik ondoriozta daiteke;
.2 Proba-laginak anplifikazio-kurba nabariak baditu FAM eta HEX kanaletan, eta Ct balioa ≤40 bada, lagina 2019ko koronabirus berrirako (2019-nCoV) positiboa dela epaitu daiteke.
7.3 Proba-laginak anplifikazio-kurba garbia badu FAM edo HEX kanal batean bakarrik, eta Ct balioa ≤40 bada, eta beste kanalean anplifikazio-kurbarik ez badago, emaitzak berriro probatu behar dira. Berriro probatu diren emaitzak koherenteak badira, lagina positibotzat jo daiteke berrirako.
2019ko koronabirusa (2019-nCoV). Berriro probaren emaitza negatiboa bada, lagina negatiboa dela 2019ko koronabirus berrirako (2019-nCoV) epaitu daiteke.
Epaiketa positiboaren balioa
ROC kurbaren metodoa erabiltzen da kitaren erreferentziazko CT balioa zehazteko eta barne-kontrolaren erreferentziazko balioa 40 da.
Probaren emaitzen interpretazioa
1. Esperimentu bakoitza kontrol negatibo eta positiboetarako probatu behar da. Probaren emaitzak kontrolek kalitate-kontrolaren baldintzak betetzen dituztenean bakarrik zehaztu daitezke.
2. FAM eta HEX detekzio-kanalak positiboak direnean, CY5 kanalaren (barne-kontrol-kanala) emaitza negatiboa izan daiteke sistemaren lehia dela eta.
3. Barne-kontrolaren emaitza negatiboa denean, probeta-hodiaren FAM eta HEX detekzio-kanalak ere negatiboak badira, sistema desgaituta dagoela edo funtzionamendua okerra dela esan nahi du, eta proba baliogabea da. Beraz, laginak berriro probatu behar dira.
